A Cumarina - (Canela, pimentas)

Pimenta Caiena

• Cumarinas são lactonas do ácido o-hidroxi-cinâmico. São amplamente distribuídos nos vegetais, como o guaco e a castanha da índia, (muito utilizada contra varizes), emburana, agrião, cumaru e canela, entre outras, e em frutas como morango, cereja e damasco. 

Possuem um odor forte e característico de baunilha, sendo amplamente utilizadas como aromatizantes de produtos industrializados e como fixadores de perfumes. Apresentam atividade antibiótica, broncodilatadora, fungicida, anticoagulante, vasodilatadora, espasmolítica e antitrombótica.

• A cumarina tem sido usada também como aromatizante de fumos e algumas bebidas alcoólicas, embora seja proibido o seu uso como flavorizante de alimentos, em razão de sua possível hepatotoxicidade. 

As cumarinas são substâncias de origem natural resultantes do metabolismo secundário, amplamente distribuídas nos vegetais (predominantemente nas Angiospermas), mas também podem ser encontradas em fungos e bactérias. 

• A palavra cumarina origina-se do tupi "kumarú" (ou cumaru) nome popular dado à árvore cujo nome botânico é Dipteryx odorata. Esta planta pode ser encontrada no Norte do Brasil e suas sementes contém de 1 a 3% de cumarina. Além do cumaru, a cumarina pode ser encontrada em diversas outras espécies de plantas, tais como guaco, agrião, canela, nas frutas como morango, cereja e damasco.

Em geral, são lactonas do ácido o-hidroxi-cinâmico, sendo a cumarina o representante mais simples (1,2-benzo pirona). As cumarinas podem existir tanto no estado livre, como conjugadas com açúcares, ou também preniladas. Esta versatilidade dá origem a mais de 1000 compostos conhecidos. 

• Eram utilizadas como aromatizantes em alimentos, porém seu uso foi proibido devido à toxidade hepática de alguns compostos. Devido ao seu odor acentuado, a estabilidade e ao baixo custo, a cumarina passou a ser amplamente utilizada na indústria de produtos de limpeza, cosméticos, perfumaria, aditivo em tintas e tabaco. Também possui propriedades antibióticas, anti-inflamatória, bronco dilatadora, fungicida e anticoagulante.

Atividade Antibacteriana: 

De cumarinas naturais e derivados:

• O Brasil possui uma característica territorial muito diferente dos países industrializados, que é a sua biodiversidade, (55 mil espécies vegetais, 22% do total registrado no planeta) sendo, portanto, um celeiro para pesquisa de substâncias novas, de interesse biológico ou não (PINTO et al., 2002, p. 48).

O arsenal terapêutico do reino vegetal é incalculável e, no momento, uma pequena porcentagem dos compostos naturais é conhecida. Estas substâncias podem ser utilizadas diretamente ou como modelos para a síntese de novos princípios úteis no tratamento de infecções (DOMINGO; LÓPEZ-BREA, 2003, p. 392).

• Tradicionalmente, os produtos naturais de plantas têm provido à indústria farmacêutica uma de suas mais importantes fontes de compostos “modelos” e acima de 40% das drogas modernas são derivadas de fontes naturais usando a própria substância natural ou a versão sintetizada (JASSIM; NAJI, 2003, p. 413). 

Além do mais, produtos naturais são reconhecidos amplamente na indústria farmacêutica não só por sua diversidade estrutural como também, seu largo espectro de atividades farmacológicas (OJALA, 2001, p. 11).

• O potencial dos produtos naturais tem sido reconhecido desde a Antiguidade. A elucidação estrutural bem como o papel desses compostos de ocorrência natural nas interações biológicas dos organismos e nos seus ecossistemas está sendo entendido apenas recentemente (BANERJI, 1992, p. 105).

Devido às capacidades bioquímicas especializadas, as plantas são capazes de sintetizar e acumular uma vasta linha de metabólitos primários e secundários (OJALA, 2001, p. 12) a maioria relacionada com o fenol e seus derivados (DOMINGO; LÓPEZ-BREA, 2003, p. 386), úteis na defesa da própria planta contra fatores de estresse. Esses compostos tornam muitas plantas úteis para seres-humanos, tanto na dieta como em medicamentos (OJALA, 2001, p. 12).

• Embora os compostos de origem vegetal representem quase a metade de todos os medicamentos dispensados nos Estados Unidos, muito poucos são usados como antimicrobianos, já que para essa categoria de fármacos, são exploradas, principalmente, fontes bacterianas e fúngicas. Desde o advento dos antibióticos na década de 50, o uso de antimicrobianos de origem vegetal tem sido virtualmente inexistente (COWAN, 1999, p. 564).

Entretanto, as plantas possuem uma grande quantidade de compostos químicos com potencialidade para uso como antimicrobiano alguns dos quais, com atividade in vitro comparável àquele dos antimicrobianos utilizados na clínica (DOMINGO & LÓPEZ-BREA, 2003, p. 392).

• Um grupo de substâncias promissoras para o estudo de novos antimicrobianos é o das fitoalexinas. Esses compostos são dotados de propriedades antimicrobianas e são produzidas pelas plantas quando estas são infectadas por microorganismos fitopatogênicos (vírus, bactérias e fungos) ou quando estão sob ação de fatores causadores de estresse, como por exemplo, o frio, clima árido, ação da luz ultravioleta, entre outros. 

As fitoalexinas aparecem, geralmente, em altas concentrações em resposta à infecção, desempenhando nas plantas um papel semelhante ao dos anticorpos nos animais (PINTO et al., 2002, p. 54). 

• Dentre as fitoalexinas, o grupo das cumarinas (da família dos compostos fenólicos) vem despertando grande interesse biotecnológico em função das diferentes bioatividades atribuídas a alguns de seus membros como propriedades anti-inflamatórias, antitrombóticas e vasodilatadoras (DOMINGO; LÓPEZ-BREA, 2003, p. 387).

A resistência antibacteriana global está se tornando um problema de saúde pública crescente, sendo citada para quase todos os antibacterianos disponíveis. A indústria farmacêutica e as companhias de biotecnologia estão respondendo à ameaça da resistência antibiótica com renovados esforços na descoberta de novos antibacterianos. 

• Estratégias em curto prazo estão focadas na bioprospecção de novos agentes antibacterianos ativos contra microrganismos multiresistentes específicos e, em longo prazo, o uso de técnicas de sequenciamento genômico microbial direcionado para a descoberta de novos agentes ativos contra alvos bacterianos (BAX; MULLAN; VERHOEF, 2000, p. 51) pré-determinados.

O interesse por protótipos farmacêuticos úteis oriundos de plantas usadas na medicina popular tem levado ao ressurgimento de interesse nas cumarinas e produtos naturais fenólicos relacionados como os flavonóides. 

• Isto porque, substâncias purificadas, exibem atividades farmacológicas potentes e relevantes e que são estrutura-dependente, além de apresentarem baixa toxicidade em mamíferos. Essa combinação de propriedades mantém as cumarinas como alvo de interesse farmacêutico (HOULT; PAYÁ, 1996, p. 714).

Cumarinas:

• Desde 1820 quando Vogel isolou pela primeira vez a 1,2-benzopirona (cumarina) da planta Coumarouna odorata (Dipteryx odorata, Willd, Fabaceae) popularmente conhecida como fava tonca, as cumarinas vêm sendo reconhecidas como produtos naturais amplamente distribuídos nas plantas (MURRAY, 1978, p. 200).

Em 1940, Link e colaboradores isolaram uma cumarina dimérica, o dicumarol (bis-4-hidroxicumarina) de folhas em decomposição de Melilotus officinalis (Linné) Pall. (Fam. Lamiaceae) (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1996, p. 135) popularmente conhecida como trevo-doce (Fig. 2) a qual foi identificada como o agente causador da doença hemorrágica fatal do gado (ROJAHN, 1956, p. 1754; HEGELAND, 1980, p. 66). 

• Desde então, um número grande de 4-hidroxicumarinas substituídas tem sido sintetizado, entre elas a Warfarina que vem sendo empregada com sucesso na terapia anticoagulante (HEGELAND, 1980, p. 66).

Atualmente, mais de 1.300 cumarinas já foram identificadas de fontes naturais, especialmente de plantas verdes. As propriedades farmacológicas, bioquímicas e aplicações terapêuticas de cumarinas simples dependem de seus padrões de substituição (HOULT; PAYÁ, 1996, p. 713).

Aspectos botânicos:

• As cumarinas estão presentes em diferentes partes das plantas como nas raízes, nas flores e frutos de algumas famílias de Angiospermae como Apiaceae, Rutaceae, Asteraceae, Graminae e Orquidaceae (monocotiledônias) bem como em Fabaceae, Oleaceae, Moraceae e Thymeleceae, entre outras. Dentre os táxons que biossintetizam cumarinas existem espécies bastante diversificadas, como árvores, arbustos e ervas (RIBEIRO; KAPLAN, 2002, p. 533).

Embora sintetizadas, principalmente, nas folhas cumarinas ocorrem em níveis mais altos nas frutas, seguido pelas raízes e caule. Além disso, mudanças sazonais e condições ambientais podem afetar a ocorrência em várias partes da planta (OJALA, 2001, p. 16).

• Furanocumarinas que ocorrem, particularmente, nas famílias Rutaceae e Umbeliferae (TREASE; EVANS, 1983, p. 384) inibem o crescimento da extremidade da raiz e sua excreção na superfície das sementes pode ser um meio de retardar a germinação (OJALA, 2001, p. 16).

Biogênese:

• A síntese dos metabólitos secundários de plantas deriva, principalmente, do metabolismo da glicose via dois intermediários principais: ácido chiquímico e acetato.

A via do ácido chiquímico (chiquimato) produz três aminoácidos aromáticos: fenilalanina, triptofano e tirosina, que intermediam a biossíntese de numerosos produtos naturais aromáticos em plantas superiores (SHIMID; AMRHEIN, 1995, p. 737) entre eles, os alcalóides, taninos, lignanas, ligninas e cumarinas.

• Compostos cumarínicos também são produzidos por fungos e bactérias.

Os metabólitos secundários podem ser encontrados na forma livre, sendo denominados genericamente de agliconas ou estar ligado a uma ou mais unidades de açúcar formando o que se denomina heterosídeos (SANTOS, 1999, p. 333).

• As cumarinas são derivadas do metabolismo da fenilalanina, sendo um dos seus primeiros precursores do ácido p-hidróxi-cinâmico (ácido p-cumarínico), que é hidroxilado na posição C-2’ (orto-hidroxilação). 

O derivado orto - hidroxilado sofre isomerização fotocatalizada da ligação dupla (E􀃆Z). O isômero Z lactoniza-se, espontaneamente, produzindo a umbeliferona (7-hidroxicumarina) (KUSTER; ROCHA, 1999, p. 454). 

• Em alguns casos, glicosilação do ácido cinâmico ocorre, (impedindo a lactonização). Em tais casos, cumarina surge após injúria tecidual e hidrólise enzimática. Quando isso ocorre, o ácido cinâmico glicolisado sofre ação de uma glicosidase, e sua molécula de açúcar é retirada e o ácido cinâmico esterifica formando a cumarina. 

A formação de di-e trihidroxicumarinas e seus éteres envolvem a hidroxilação da umbeliferona (7-hidroxicumarina) e não a lactonização dos ácidos cinâmicos correspondentes (BRUNETON, 1995, p. 231). 

• A prenilação do anel benzênico nas posições C6 ou C8 do derivado 7-hidroxicumarina é o passo inicial na biogênese das furanocumarinas e piranocumarinas. A ciclização dos derivados C6 ou C8 – isoprenilcumarina ocorre por ataque nucleofílico do grupo hidróxido em C7 ao epóxido formado pela oxidação da ligação dupla do resíduo isopentila. 

Dependendo da orientação do ataque nucleofílico, o produto poderá ser o hidroxi -iso-prop il-di-hidrofurano cumarina ou o hidroxi-dimetil -di-hidropiranocumarina (KUSTER; ROCHA, 1999, p. 454). A prenilação na posição C6 origina furanos e piranocumarinas lineares e na posição C8 homólogos angulares (BRUNETON, 1995, p. 231). 

• A maioria das cumarinas é derivada biogeneticamente da via do ácido chiquímico, mas um número significativo delas parece derivar de uma via mista (ácido chiquímico e acetato) como as 4-fenilcumarinas. As 4-n-propilcumarinas, por exemplo, derivam totalmente da via do acetato (KUSTER; ROCHA, 1999, p. 454).

Classificação química das cumarinas:

• A cumarina per se é o esqueleto básico de todos os outros derivados e é considerada quimicamente como a fusão dos anéis benzeno e 1,2-pirona (primeiro átomo numerado do ciclo é o oxigênio sem dupla ligação) (COSTA, 1994, p. 591) e podem ser classificadas como segue: cumarinas simples, furanocumarinas, piranocumarinas, cumarinas com substituintes no anel pirona e cumarinas miscelâneas (MURRAY, 1989, p. 591-618: BRUNETON, 1995, p. 230; ROJAHN, 1956, p. 1757).

Cumarinas simples:

• Compreendem os derivados da cumarina per se contendo radicais hidroxi, alcóxi, alquil bem como as formas glicosídicas. A oxigenação ocorre em um ou mais das seis posições do núcleo da cumarina, sendo que as cumarinas sem átomos de oxigênio são de rara ocorrência. Exceto em casos raros todas as cumarinas tem grupos hidroxila no carbono C7. 

Esses grupos podem estar metilados ou com ligação glicosídica. Grupos isoprenóides são comuns a muitas cumarinas sejam elas simples ou ligadas a anéis furanos ou piranos.

Furanocumarinas:

• Estes compostos consistem de um anel furano (anel de 05 membros) condensados ao núcleo cumarínico, e se subdividem em lineares e angulares com substituintes ligados às posições dos demais anéis benzenóides (C5, C6, C7 e C8).

Piranocumarinas:

• Análogos as furanocumarinas, porém com anel pirano (06 membros).

Cumarinas com substituintes no anel pirona:

• São cumarinas com grupos substituintes na posição C3 e C4.

Cumarinas miscelâneas:

• Compreendem biscumarinas (cumarinas diméricas como o dicumarol) e as isocumarinas que com relação a cumarina, tem o átomo de oxigênio e o carbono ligado ao oxigênio por dupla ligação invertidos de posição.

Propriedades, extração e caracterização:

• A cumarina ocorre como cristais prismáticos, incolor com odor de fragrância característica e de sabor amargo, aromático e picante. Quando em estado livre é solúvel em álcool e em outros solventes orgânicos como o éter e solventes clorados, com os quais ela pode ser extraída. Em meio alcalino, o anel lactônico se abre, enquanto que a acidificação em meio aquoso recupera o anel (relactonização) (BRUNETON, 1995, p. 233).

Algumas cumarinas são sensíveis a pH ácidos ou alcalinos, levando ao isolamento de artefatos ao invés do isolamento das cumarinas originais, portanto, é necessário identificar quais cumarinas estão presente em extratos vegetais antes do tratamento químico, o que pode ser obtido usando cromatografia de camada delgada onde elas podem ser facilmente identificadas devido a característica de fluorescência da maioria das cumarinas sob luz ultravioleta (MURRAY, 1978, p. 204-205). 

• A técnica de isolamento por CLAE tem sido usada por um grande número de pesquisadores, mostrando-se uma das mais eficientes (MURRAY, 1978, p. 206).

A determinação estrutural das cumarinas é feita através dos métodos espectroscópicos de análise tais como a infravioleta e infravermelho, RNM, e massa (MURRAY, 1978, p. 206-207).

Importância comercial das cumarinas:

• Cumarinas são compostos orgânicos que possuem aplicações extensas e diversas. Exibem forte fluorescência na região VIS (visível) que as tornam apropriadas para uso como colorantes, laser de corante e cromóforos óticos não lineares (KOVAC; NOVAC, 2002, p. 1483).

Em solução amoniacal, estes compostos exibem uma fluorescência azul, azul-esverdeada ou violeta, que tem sido utilizado como teste qualitativo para resinas como asafetida (TREASE; EVANS, 1983, p. 384).

• Uma solução de 1:200 é empregada como inseticida (ROJAHN, 1956, p. 1751). A cumarina é uma das substâncias aromáticas que mais tem tido emprego de caráter geral. Por longo tempo, foi utilizada para aromatizar manteiga, o tabaco, numerosos medicamentos e perfumes (ROJAHN, 1956, p. 1751). 

Além disso, os seres humanos estão expostos as cumarinas como fragrâncias em produtos cosméticos, tais como desodorantes antiperspirantes, produtos para banho, loções corporais, eau de toilette, cremes faciais, fragrâncias em creme, spray de cabelo, xampus, gel de banho e sabonetes de banho. É estimado que a exposição humana diária a cumarinas seja de cerca de 0,04 mg/kg/dia em cosméticos e perfumaria (LAKE, 1999, p. 424).

Cumarinas na dieta

• As cumarinas fazem parte da dieta do ser humano e de outros animais. São encontradas em vegetais da família das umbelíferas como a cenoura, o aipo, a salsa e a chicória; bem como nas frutas mirtilo e toranja (grapefruit). Outras fontes desses derivados ainda incluem o chá verde e a canela. Estima-se que cerca de 0,02 mg/kg/dia de cumarinas seja a quantidade que os seres humanos estão expostos diariamente (LAKE, 1999, p. 425).

De acordo com o Anexo II do Council Directive, 1988 (88/388/EEC) o limite geral permitido do uso de cumarinas no alimento e em bebidas não -alcoólicas é de até 2mg/kg; entretanto, em bebidas alcoólicas e caramelo o limite permitido é de 10 mg/kg e em goma de mascar é de 50mg/kg.

Farmacocinética:

• Quando ocorre a aplicação tópica de produtos contendo cumarinas, a absorção (cerca de 60%) é rápida e extensiva pela pele humana (e de roedores), permanecendo metabolicamente imutáveis durante a absorção (BECKLEY-KARTEY; HOTCHKISS; CAPEL, 1997, p. 34). 

Na maioria dos estudos com seres humanos, a cumarina é rapidamente absorvida no trato gastrintestinal (ingestão oral), distribuída pelo organismo e metabolizada extensivamente pela CYP2A6 hepática à 7-hidroxicumarina, que é excretada na urina sob a forma de conjugados sulfatados e glucuronido (LAKE, 1999, p. 434). 

• Assim sendo, a isoforma do citocromo P450 responsável pela 7-hidroxilação da cumarina é o P450 2A6, que segundo Yun; Shimada; Guegerich (1991, p. 679) constitui no máximo 1% do P450 total presente no fígado humano. 

As cumarinas podem ser metabolizadas por hidroxilação em todas as 6 posições possíveis (átomos de carbono 3, 4, 5, 6, 7 e 8) para produzir 3-,4-,5-,6-,7- e 8-C hidróxicumarinas e por abertura do anel lactona resultando em vários produtos incluindo o o-hidroxifenilacetaldeído (o-HPA), o o-hidroxifeniletanol (o-HPE), o ácido o-hidroxifenilacético (o-HPAA) e o ácido o-hidroxifenilático (o-HPLA). 

• Outros metabólitos menores incluem ainda a 6,7-hidroxicumarina, o ácido o-cumárico, o ácido o-hidroxifenilpropiônico e a dihidrocumarina. A 7-hidroxilação é a via principal para o metabolismo das cumarinas em seres humanos (HADIDI et al., 1997, p. 903), porém, alguns indivíduos podem também metabolizar a cumarina por 3,4 epoxidação ou por outras vias que levem a formação de o-HPAA. 

Diferenças interindividuais no metabolismo da cumarina demonstraram a existência de alelos variantes no gene CYP2A6 humano (CYP2A6*2 e CYP2A6*3) (LAKE, 1999, p. 430). Quando a esses indivíduos é administrado cumarina por via oral, ao invés de ser detectado na urina a 7-hidroxicumarina, são observados a presença do ácido 2-hidroxifenilacético (cinqüenta por cento da dose) e o produto final que resulta da hidroxilação da cumarina na posição C3, a 3- hidroxicumarina. 

• Estes dados alertaram para o risco da exposição dessas pessoas às cumarinas, uma vez que a 7-hidroxilação está relacionada com a via de detoxificação, enquanto que a 3-hidroxilação é um processo que resulta na ligação covalente da cumarina a proteínas microssomais (HADIDI et al., 1997, p. 903).

Diferença notória com relação ao metabolismo das cumarinas entre as espécies animais tem sido observada (LAKE, 1999, p. 427). Enquanto que a 7-hidroxilação é a via principal do metabolismo da cumarina em seres humanos e babuínos, é uma via irrelevante em outras espécies. 

• Por exemplo, a via principal do metabolismo das cumarinas em ratos é a 3,4 epoxidação (ou 3-hidroxilação) (por isoformas de citocromo P450 ainda não elucidadas) resultando na formação de metabólitos de anel aberto como o o-HPA, o-HPE e o o-HPAA (LAKE, 1999, p. 430) os quais são responsáveis pelo efeito hepatotóxico nesses animais. Assim, a hepatotoxicidade parece estar mediada pelo metabolismo, que no caso dos roedores está ligada a 3-hidroxilação e quebra do anel heterocíclico (FENTEM; FRY, 1993, p. 1). 

Essa ação tóxica das cumarinas provoca necrose hepática e deprime atividade de um número de enzimas hepáticas, em 24 horas (LAKE, 1984, p. 16) e pode ser parcialmente atribuída a excreção dos metabólitos cumarínicos na bile (LAKE, 1999, p. 444).

• Apesar das cumarinas não mostrarem ser carcinógenos genotóxicos nesses animais, outros mecanismos são necessários para explicar porque altas doses desse composto podem produzir tumores hepáticos e pulmonares (LAKE, 1999, p. 445).

A ação indesejável de cumarinas mais complexas como as furanocumarinas (por exemplo: 8-metoxipsoraleno ou xantotoxina) foi estudada em células humanas e atribuída à inibição da isoforma P450 2A6 humana (KOENIGS et al., 1997, p. 1413) diminuindo assim a capacidade de metabolização de alguns de seus substratos como a nicotina, o butadieno e a aflatoxina B. 

• O bergapteno (ou 5-metoxipsoraleno), presente na fruta toranja (grapefruit), inibe a atividade do citocromo CYP3A4 (GUO et al., 2000, p. 122-123; WEN et al., 2002, p. 977) de 40-100% em hepatócitos de macacos e homens (WEN et al., 2002, p. 983) sendo o CYP 3A4, nesse último, um constituinte principal em relação ao metabolismo de drogas (GUO et al., 2000, p. 122-123). Sahi et al. (2002, p. 135) demonstraram que bergapteno aumenta a biodisponibilidade oral do Diazepan em cães Beagle (pela inibição da atividade enzimática do P450) e que ao mesmo tempo pode tanto induzir como inibir a atividade da CYP1A1/2.

Geralmente, a meia vida para eliminação das cumarinas é similar em todas as espécies já examinadas, sendo por volta de 1 a 2 horas em humanos e entre 1 e 4 horas em outras espécies (camundongos, ratos, hamster siberiano, coelho, babuíno). Embora, na maioria das espécies a rota de excreção seja a urina, excreção biliar ocorre em ratos, resultando na presença de metabólitos cumarínicos nas fezes (LAKE, 1999, p. 426).

Toxicidade em modelo animal e fototoxicidade:

• A toxicidade da cumarina e da 3,4-dihidrocumarina foram estudadas pela FDA (Food and Drug Administration) e o National Cancer Institute devido ao uso em alta escala desses metabólitos em perfumes (fixadores e realçadores), cosméticos e fragrâncias e realçadores de aromas para alimentos. 

O estudo foi conduzido com ratos e camundongos onde se observou evidências de efeitos carcinogênicos e nefropáticos. (NPT, 1993, p. 1-4). Entretanto, segundo Lake (1999, p.444) o rato é um modelo animal impróprio para avaliação da segurança da exposição de seres humanos as cumarinas.

• Ao contrário do que acontece com ratos e camundongos, onde doses altas de cumarina podem produzir toxicidade e carcinogenicidade, há pouca evidência de toxicidade induzida pela cumarina em seres humanos, quando são administradas doses até 1900 vezes maiores do que aquelas obtidas de fontes dietéticas e de cosméticos (LAKE, 1999, p. 444). 

Os estudos de Born et al. (2000, p.23) sugeriram que em humanos, é improvável que ocorra a produção do metabólito o-HPA em concentrações toxicologicamente relevantes se expostos a nível baixo de cumarina. Segundo Ojala (2001 p. 29) a possibilidade de efeitos fototóxicos de furanocumarinas e hepatotóxicos de aflatoxinas (metabólitos cumarínicos de espécies de Aspergillus), entretanto, deve ser levada em consideração. Xantotoxina (8-MOP, 8-metoxipsoraleno), bergapteno (5-MOP, 5-metoxipsoraleno) e trioxsaleno (TMP) são furanocumarinas (psoralenos) utilizadas no tratamento de algumas desordens dermatológicas (psoríases, vitiligo, e micose) em combinação com luz ultravioleta 

• A (320 a 400nm), constituindo um tratamento conhecido como PUVA - (psoralenos - por exemplo, xantotoxina, bergapteno ou trioxsaleno + UVA) (SAID et al., 1997, p. 136; SCHIMITT; CHIMENTI; GASPARRO, 1995, p. 101). 

A eficácia da fotoquimioterapia em questão é atribuída à formação de fotoadutos entre psoralenos e DNA, bem como com outros componentes celulares (SCHIMITT; CHIMENTI; GASPARRO, 1995, p. 101). Psoralenos causam danos ao ligar-se covalentemente ao DNA seguido de irradiação UVA. As moléculas de psoralenos exibem estruturas tricíclicas planares com dois sítios fotoreativos (3,4-pirona e 4’, 5’-dupla ligação furano). 

• A intercalação inicial e a interação com o DNA dupla hélice são caracterizadas pela absorção de um fóton de UVA, um resíduo de pirimidina (principalmente timina) do DNA se liga covalentemente ao primeiro sítio fotoreativo. O monoaduto resultante pode formar um diaduto pela absorção do segundo fóton se uma nova pirimidina no lado oposto da fita de DNA se estiver disponível para uma ligação cruzada entre as fitas (LAPRONTI et al., 2003, p. 190).

Em baixas doses de psoralenos mais UVA, as células acometidas de psoríases são colocadas em estado citostático onde processos celulares podem ser suspensos até que o dano subletal no DNA seja reparado (BETHEA et al., 1999, p. 79). Com relação ao vitiligo, a eficácia do tratamento é devido a pigmentação induzida por PUVA a qual pode estar relacionada a conversão fotoassistida da glutationa celular a glutationa oxidada (ISCHIA; NAPOLITANO; PROTA, 1989, p.143). 

• Já o 8-MOP estimula a pigmentação através da estimulação de níveis de expressão do MTIF (microphthalmia-associated transcription factor) através ativação da via da proteína quinase A, que por sua vez estimula a expressão de tirosinase e aumento da melanina em melanoblastos (LEI et al., 2002, p. 1341). 

Fototoxicidade é o efeito adverso mais significante em curto prazo em terapia com PUVA acometendo 10,9% dos pacientes e causando efeito colateral em 0,3% dos tratamentos ocasionado principalmente por dificuldade em seguir o protocolo do tratamento (MORISON; MARWAHA; BECK, 1997, p. 183). Os sintomas são eritema com bolhas, pigmentação epidérmica (GANGE; PARRISH, 1984, p. 117).

• A reação fototóxica causada pelo contato com plantas contendo furanocumarinas (família Umbelliferae) após exposição aos raios de sol, a fitofotodermatite, se caracteriza por eritema com hiperpigmentação pós-inflamatória.(WAGNER et al., 2002, p. 10; LAGEY et al., 1995, p. 542). Compostos químicos fototóxicos produzidos por plantas são agentes protetores que são liberados em caso de haver danos físicos causados por mamíferos e insetos herbívoros. (BERENBAUM, 1995, p. 119).

Efeitos biológicos das cumarinas:

• As cumarinas possuem um espectro amplo de atividade biológica. Recentes estudos sobre as atividades biológicas das cumarinas estão apresentados na Tabela I e alguns são discutidos a seguir. Entre os estudos mais promissores, podem ser citados aqueles relacionados com a atividade antiprotozoária “in vitro”. 

Scio et al. (2003, p. 634) isolaram da planta Kielmeyera albopunctata a cumarina 4-(1-metilpropil)-5,7-dihidroxi-8-(4-hidroxi-3-metilbutiril)-6-(3-metilbut-2-enil) cromen-2-ona e observaram que esta apresenta atividade “in vitro” contra formas tripomastigotas de Trypanossoma cruzi, matando 80% dos parasitas após 24h de contato dessa substância com sangue infectado. Amotosalen HCl (psoraleno) e uso de radiação de UVA se mostraram efetivos para eliminar formas tripomastigotas, em concentrados plaquetários e plasmáticos, infectados por T. cruzi. (VAN VOORHIS et al., 2003, p. 475). 

• A dafnetina (7,8 dihidroxicumarina) tem potente atividade antimalárica, demonstrada “in vitro” contra Plasmodium falciparum provocando redução em 60% atividade. da enzima superóxido dismutase (SOD), além de diminuir a síntese de DNA do parasita (MU; WANG; NI, 2003, p.157). Esta ação é atribuída a atividade quelante de ferro da dafnetina (MU; WANG; NI, 2002, p. 83) que também exibiu atividade esquizonticida contra P. falciparum, comparada a ação da cloroquina (1~10 μmol/L) “in vitro” (WANG et al., 2000, p. 204). 

A atividade antimalárica também foi demonstrada com a cumarina 5,7-dimetoxi-8-(3’-hidroxi-3’metil-1’-buteno), encontrada em extrato metanólico das raízes da planta Toddalia asiática (OKETCH-RABAH et al., 2000, p. 636).

• Campos-Toimil et al. (2002, p. 783) sintetizaram derivados cumarínicos e furanocumarínicos com atuação vasorelaxante em anéis pré-contraídos da aorta de ratos com noradrenalina ou por despolarização com KCl (cloreto de potássio) e se mostraram promissores agentes anti-hipertensivos e/ou espasmolíticos. 

Ostol, outro derivado cumarínico tem ação vasorelaxante nos tecidos do corpo cavernoso de coelhos atribuído a liberação de NO (ácido nítrico) do endotélio sinusoidal e potenciação do relaxamento mediado por sinais do cGMP (guanosina monofosfato cíclico) e / ou cAMP (adenosina monofosfato cíclico) pela inibição da fosfodiesterase. O ostol é, portanto, um agente candidato para tratamento da impotência.(CHEN et al., 2000, p. 1975).

• A DNA girase bacteriana é o alvo enzimático da classe de antibióticos aminocumarínicos (Novobiocina, Coumermicin A1 e Clorobiocina) que são produzidos por cepas de Streptomyces (LAURIN et al., 1999, p. 2079). As drogas se ligam à subunidade B da girase bacteriana, inibindo a atividade da enzima ATPase (GORMLEY et al., 1996, p. 5083) sendo seletivamente ativas contra Staphylococcus aureus (LONG, 2003, p. 351).

Diversos estudos relatam a atividade antiviral das cumarinas, por diferentes mecanismos. Piranocumarinas presentes no látex de árvores do gênero Calophyllum são inibidoras da enzima transcriptase reversa do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV).

A canela é uma das especiarias mais importantes do mundo para condimentar alimentos e bebidas, mas tem variedades distintas: a canela do Ceilão, cultivada no Sri Lanka, Madagascar e nas ilhas Seicheles, é conhecida como “canela verdadeira” e é muito cara

Fuller et al. (1994, p. 1961) e Gustafson et al. (1994, p. 5821) isolaram piranocumarinas com ação anti-HIV, respectivamente costatolido (inibidora da transcriptase reversa) e soulatrolido do látex de C. teysmanii. Atividade semelhante à dessas cumarinas foi também encontrada para uma outra piranocumarina, a calanolido B, a qual foi isolada de outra espécie do mesmo gênero, a C. cerasiferum (SPINO; DODIER; SOTHEESWARAN, 1998, p. 3475). 

• A inibição da transcriptase reversa não é o único mecanismo antiviral das cumarinas. A 4-hidróxi-3-(3-fenóxipropil) cumarina desempenha ação anti-HIV pela inibição da enzima protease do vírus (TUMMINO et al., 1996, p. 1401). Uma terceira enzima viral, a integrase, tem sua ação inibida por uma série de cumarinas diméricas quimicamente modificadas (cuja potência é maior naquelas contendo fração hidrofóbica) (MAO et al., 2002, p. 1634). 

Algumas cumarinas como as 3-fenilcumarinas ainda suprimem, em nível gênico, a expressão do HIV, inibindo sua transcrição viral na região do promotor (UCHIUMI et al., 2003, p. 89). Cumarinas e biscumarinas (pabulenol, heraclenol, oxipeucedanina, pranferol e xantotoxina), da planta Férula sumbul, são inibidoras da replicação do HIV em linfócitos H9 com índice terapêutico superior a 1.000 (ZHOU et al., 2000, p. 689). 

• As cumarinas são também importantes antioxidantes naturais (ZHANG; WANG, 2004, p. 199). Nishiyama; Ohnishi; Hashiguchi (2001, p. 1127) mostraram atividade antioxidante da 7 hidroxicumarina em fibroblastos humanos. A cumarina per se, a 7-hidroxicumarina e 3-hidroxicumarina são indutoras da quinona reductase e outras enzimas anticarcinogênicas detoxificantes de Fase 2 “in vivo” (DINKOVA-KOSTOVA, 2002, p. 595). 

As 4-metilcumarinas, principalmente aquelas contendo dois grupos hidroxi ou acetoxi nas posições orto, no anel benzenóide, mostram propriedades fortemente antioxidantes, melhores que as do α-tocoferol (vitamina E) (RAJ et al., 1998, p. 833). 

• Kaneko; Baba; Matsuo (2003, p. 239) pesquisaram e comprovaram os efeitos protetores das cumarinas esculina, esculetina, 4-metilesculetina e fraxetina contra citotoxicidade induzida por hidroperóxido de ácido linoleico em células endoteliais venosas de cordão umbilical humano em cultura, atribuídos à presença da unidade orto catecol nas cumarinas. Entretanto, a unidade 1,2 pirona tem pouca influência na atividade antioxidante das cumarinas (ZHANG; WANG, 2004, p. 199). 

A fraxetina (7,8-dihidroxi-6-metoxicumarina) também protegeu “in vivo”, a Drosophila melanogaster contra os efeitos do estresse oxidativo por causar aumento importante das reservas da enzima glutationa redutase (GSH), prevenindo dano peroxidativo (FERNANDEZ-PUNTERO et al., 2001, p. 777). Kleiner; Reed; DiGiovanni (2003, p. 415) estudaram a ação antioxidante de cumarinas presentes naturalmente na dieta (frutas cítricas, por exemplo) como a bergamotina, a imperatorina e a isopimpinelina e demonstraram que, essas cumarinas, são capazes de inibir a ação de enzimas metabolizadoras pró carcinógenas e bloquear a bioativação de agentes carcinogênicos como o B{a}P(benzo[a]pireno) e DMBA (7,12-dimetil Benz[a]antraceno promotores de formação de adutos de DNA em células MCF-7 (linhagem celular de adenocarcinoma mamário humano).

• Inúmeros trabalhos sobre a atividade antiinflamatória das cumarinas já foram publicados. Paya et al. (1994, p. 445) observaram que cumarinas 7,8-dihidroxiladas como a fraxetina são agentes capazes de sequestrar radicais ânions superóxido oriundos de neutrófilos fagocíticos ativados, os quais estão implicados em vários aspectos do processo inflamatório. Murakami et al. (2000, p. 1843) estudaram a atividade antiinflamatória do aurapten (uma cumarina prenilada) na derme de ratos tratada com 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato. Os achados indicaram que o aurapteno, encontrada em frutas cítricas, é um agente atenuador da resposta bioquímica de leucócitos inflamatórios. Estudos “in vitro”, mostraram que suprimiu a expressão de iNOS/COX-2 (Óxido Nitrico Sintetase

Induzivel /Ciclooxigenase-2) e a liberação de TNF-α (citocina pró-inflamatória, liberada por macrófagos e monócitos em resposta a estímulos inflamatórios externos ou de estresse) fatores esses com papéis importantes na patogênese da inflamação e câncer. A (8-monocloro-3-β-dietilaminoetil-4-metil-7-etoxi-carbonil-metoxi-cumarina é uma cumarina semi-sintética que segundo Corsini et al. (2001, p. 231) demonstrou inibir a transcrição de TNF-α induzida por lipopolissacarídeo e a ativação de NF-Κb (fator nuclear -κB) em macrófagos de ratos. 

• Cheng et al. (2004, p. 2411) demonstraram a atividade de derivados cumarínicos como inibidores de TNF-α em células mononucleares do sangue periférico humano estimulados por lipopolissacarídeos bacterianos “in vitro”, sugerindo que esses derivados com substituintes em C6 (principalmente halogênios) influenciam o efeito inibitório com atividade nanomolar. 

Curini et al. (2004, p. 2241) sintetizaram e verificaram a atividade antiinflamatória de geraniloxicumarinas. A atividade antiinflamatória tópica foi avaliada usando o teste do óleo de cróton na orelha de camundongo como modelo inflamatório agudo. Aurapten e seus derivados 8-metoxi e 8-acetoxi reduziram em 50% o edema, similarmente a indometacina ( droga antiinflamatória não esteroidal de referência) a 0,25 μmol/cm2m.

• O desenvolvimento tumoral é um processo de múltiplas etapas durante o qual eventos genéticos e epigenéticos determinam a transição da célula normal ao estado maligno. Comuns na maioria dos tumores, vários circuitos regulatórios estão alterados na progressão tumoral, entre eles, o controle da proliferação, equilíbrio entre sobrevivência celular e morte celular (apoptose), comunicação entre células vizinhas e com a matriz celular, a neovascularização tumoral (angiogênese) e finalmente, a migração, invasão e disseminação metastática (COMPAGNI; CHRISTOFORI, 2000, p. 1). 

Dentre as diversas cumarinas até hoje pesquisadas, algumas apresentam ação em alguns processos relacionados a gênese tumoral. A dafnetina (YANG et al., 1999, p. 682; FINN; CREAVEN; EGAN, 2004, p. 177-178) tem ação antiproliferativa por ser inibidora de proteínas quinases. Liu et al. (2001, p. 929) comprovaram os efeitos antiproliferativos da escopoletina por meio de indução a apoptose em células PC3 e WANG et al. (2002, p. 163) por inibição da fosoforilação de pRb (proteína restinoblastoma) em células HL-60 (células de leucemia humana) Praeruptorina C, um derivado cumarínico isolado da planta Peucedanum praeruptorum Dunn também é um antiproliferativo testado em células da musculatura lisa aórtica bovina (WEI et al., 2002, p. 129). 

• A 7-hidroxicumarina, o principal metabólito da cumarina em seres humanos, tem ação citostática por causar a diminuição da porcentagem de células de adenocarcinoma humano que expressam ciclina D1 (JIMENEZ-OROZCO et al., 2001, p. 185). 

A ativação da via da apoptose é o mecanismo chave pelas quais drogas citotóxicas matam células tumorais. Defeitos na sinalização da apoptose contribuem para a resistência dos tumores (DEBATIN, 2004, p. 153). A cumarina e a 7-hidroxicumarina (umbeliferona) induziram distúrbios no ciclo celular e apoptose em células do carcinoma humano (LOPEZ-GONZALEZ et al., 2004, p. 275). 

• A isocumarina sintética 2-(8-hidroxi-6-metoxi-1-oxo-1H-2-benzopiran-3-il) NM-3 mostrou possuir atividade apoptótica, por geração de ROS (espécies reativas do oxigênio) e parada do crescimento celular (YIN et al., 2001, p. 43). Em tumores malignos, a angiogênese é necessária para o crescimento de tumores sólidos e desenvolvimento de metástases (DREVS; DROLL; UNGER, 1999, p. 282). 

A NM-3 é uma molécula antiangiogênica que induz morte celular endotelial (SALLOUM et al., 2000, p. 6958), a concentrações baixas, por mecanismo não apoptótico (YIN et al., 2001, p. 43). Nam et al. (2002, p. 2345) modificaram e analisaram a relação estrutura-atividade de 4-senecioiloximetil-6,7-dimetoxicumarinas antiangiogênicas, concluindo que a fração 6,7-dimetoxi é importante para a bioatividade. 

• As MMPs (matrix metalloproteinases) estão implicadas no processo de crescimento tumoral, invasão e metástases, onde são superexpressas especialmente em fenótipos agressivos (HIDALGO; ECKHARDT, 2001, p. 178). Kempen et al. (2003, p. 1111) demonstraram a evidência de que alguns derivados cumarínicos sintéticos possuem marcantes propriedades anti-invasivas ‘in vitro” e antitumorais “in vivo”. Inibição da motilidade foi também demonstrada em estudos com células de B16-F10 (melanoma) usando a 4-hidroxicumarina (VELASCO-VELÁZQUEZ et al., 2003, p. 179).

Com o aumento dramático da resistência de patógenos agentes antimicrobianos tanto na área farmacêutica como na agroquímica, há uma necessidade crescente da descoberta de novos compostos antimicrobianos. As atividades antimicrobianas das cumarinas têm sido avaliadas com emprego de diversos protocolos e, geralmente, difíceis de serem comparadas. 

• Existem relatos sobre a eficácia de cumarinas puras contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas bem como contra fungos . Extratos vegetais também têm mostrado atividade, por exemplo: extratos em éter das raízes de Angélica gigas foram ativos contra Bacillus subtilis, Proteus vulgaris e Salmonella typhimurium (LEE, S. et al., 2003, p. 449); extratos metanólicos de Angélica archangelica L., Levisticum officinalis Koch, Peucedanum palustre (L.), 

Ruta graveolens L. Petroselinum crispum (P.Mill) foram ativas contra fungos fitopatogênicos Fusarium culmorum e Heterobasidion annosum (OJALA et al., 2000, 299); extratos de Toona ciliata e Amoora rohituka em metanol, éter de petróleo e diclorometano foram ativas contra Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, B. megaterium, B. subtilis, Escherichia coli, Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, 

• Salmonella paratyphi A e B, S. typhi, Sarcina lútea, Shigella boydii, S. dysenteriae, S. flexneriae, S. sonnei, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, V. mimicus e V. parahemolyticus e contra os fungos Macrophomina phaseolina, Botryodiplodia theobromae e Curvularia lunata (CHOWDHURY et al., 2003, 155). Sardari et al. (1999, p. 1933) ao estudar diferentes furanocumarinas, demonstraram que a presença de uma hidroxila na posição C6 do núcleo cumarínico era essencial para atividade antifúngica.

Avaliação da atividade antimicrobiana:

Dissolução e diluição das cumarinas:

• As cumarinas foram dissolvidas em DMSO (10% do volume final) e os volumes completados com caldo de Mueller-Hinton (Difco Laboratories, Detroit, USA) para uma concentração final de 2 mg/mL. A partir desta solução foram preparadas diluições usadas nos testes de atividade antibacteriana.

Microrganismos testes:

• Os estudos foram desenvolvidos com as seguintes estirpes bacterianas: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA) e Bacillus cereus MIP 96016 (Departamento de Microbiologia e Parasitologia, UFSC). 

Essas foram mantidas em caldo de cérebro e coração (Brain Heart Infusion, BHI) à -20°C, no Laboratório de Antibióticos, do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de Santa Catarina.

Preparo do inóculo:

• Os inóculos de bactérias foram preparados a partir da transferência de 300μL de cada cultura estoque para 3 mL de caldo BHI. As incubações foram mantidas por 24h a 36°C, sendo a pureza das culturas verificadas após as primeiras 8 horas de incubação em meio Ágar Sangue (Blood Agar Base, adicionado de 5% de hemácias de sangue de carneiro). 

A concentração das suspensões foi ajustada com solução fisiológica estéril (0,9% cloreto de sódio) para a turvação correspondente a 108 UFC mL-1 (tubo 0,5 da escala de McFarland) (SMÂNIA et al., 1995, p. 178-179)

Determinação da concentração inibitória mínima:

• A atividade antibacteriana foi avaliada através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pelo método de microdiluição em caldo. As substâncias teste foram dissolvidas em 100μL em dimetil sulfóxido (DMSO) previamente esterilizado por autoclavação e as soluções foram adicionadas em 900 μL de caldo Mueller-Hinton. 

Posteriormente foram preparadas diluições seriadas em concentrações variando de 2,0 a 0,0156 mg/mL as quais foram distribuídas em volumes de 100 μL em placa de microdiluição de 96 orifícios. Como controle de crescimento e de esterilidade foram usadas apenas as misturas de meio de cultura e DMSO sem a adição de agentes antimicrobianos. 

• Em cada orifício teste e de controle de crescimento foram adicionados 5μL de inóculo bacteriano. Os experimentos foram desenvolvidos em duplicata e as placas foram incubadas por 24h a 36°C. A leitura dos experimentos foi realizada primeiramente através da densidade ótica com uso de leitora de ELISA (modelo CLX800-BioTek Instrumentos, Inc.) e, posteriormente, com uso de 20 μL de revelador de crescimento bacteriano, o p-iodo nitro tetrazolium (o INT- cloreto de (2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolium, diluído 1/1 em etanol PA).

A CIM foi considerada a menor concentração da substância que inibiu o crescimento bacteriano após incubação (após revelação com INT, amarelo indica ausência de crescimento bacteriano, púrpura indica crescimento) (SMÂNIA et al., 1995, p. 178-179). Os resultados foram expressos em μg/mL.

Determinação da concentração mínima bactericida:

• Para a determinação da concentração bactericida mínima (CBM), foram transferidos 10μL de cada cultura sem crescimento aparente, para 90μL de meio de cultura apropriado. A incubação, leitura e interpretação foram realizadas conforme especificado para CIM.

A CBM foi considerada a menor concentração dos compostos que geraram redução de 99,9% no número de unidades formadoras de colônia (UFC) (SMÂNIA et al., 1995, p.178-179).

Análise dos resultados:

As cumarinas cuja relação entre o valor obtido para CBM/CIM for igual ou inferior a 4 são consideradas bactericidas. Aquelas cuja relação CBM/CIM for superior a 4 foram consideradas de atividade bacteriostática (DESHPANDE et al., 2004, p. 73-75)

• Como pode ser observado na Tabela IV, as cumarinas simples podem apresentar substituições nos carbonos 6, 7 e 8. Para facilitar o entendimento da relação entre as estruturas e atividade antibacteriana, essas serão discutidas em etapas. Na Tabela VI estão apresentados os resultados da atividade antibacteriana das cumarinas simples monossubstituídas.

A cumarina per se (composto 1) exibiu atividade inibitória contra ambas bactérias Gram- positivas e, especialmente, contra Gram- negativas. Nos estudos de Kayser; Kolodziej (1999, p. 172) a atividade da cumarina per se foi ligeiramente menor nas Gram-negativas (Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, a cumarina foi ativa na concentração 400 μg/mL, enquanto que atividade antibacteriana foi observada com 500 μg/mL para Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa). Esses autores sugerem que a atividade antibacteriana das cumarinas oxigenadas depende, aparentemente, da posição e composição dos radicais substituintes no anel aromático do esqueleto cumarínico. 

• A inclusão de uma hidroxila na posição C6 da cumarina (composto 3) resulta em decréscimo da atividade antibacteriana (o que confirma estudos anteriores de JURD et al., 1971 b, p. 2971-2974) enquanto que a inclusão de radicais menos polares como CH3 e O-CH3 restituem a atividade da cumarina principalmente contra bactérias Gram-negativas. Esses dados corroboram os estudos de Kayser; Kolodziej (1999, p. 172) que enfatizam o grau de substituição e a polaridade das substâncias como fatores importantes na definição da atividade antimicrobiana. Um radical metil na posição C6 (composto 2) bem como a presença de um grupo metoxi (composto 5) realça a atividade da cumarina principalmente contra bactérias Gram-negativas.

O radical metil em C6 confere um poder antimicrobiano maior que um radical metoxi para bactérias Gram-positivas, porém menor em comparação a cumarina (composto 1). A atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas parece não ser tão efetiva quanto nas Gram-negativas, provavelmente devido às propriedades físicas de cada bactéria. 

• A introdução de um grupo metil em C7 (composto 14) da cumarina mantém a atividade antibacteriana para Gram-negativas, porém diminuída com relação às bactérias Gram-positivas. Um grupo metoxi nesta mesma posição, entretanto, (composto 13) restitui a mesma atividade daquela da cumarina (composto 1) para todas as cepas testadas. Jurd; King; Mihara (1971 a, p. 2965-2970) mostraram que a metoxilação em C7 da umbeliferona (7-hidroxicumarina) bem como em C6 aumenta a atividade antimicrobiana contra os microorganismos testados. O derivado O-acetil da cumarina em C7 (composto 15) ou C6 (composto 4) reflete na diminuição da atividade. Entretanto, a cumarina O-acetilada na posição C6 (composto 4) é menos ativa que a 7-O –acetil-cumarina (composto 15). 

A O-acetilação na posição C6 (composto 4) faz a atividade antibacteriana da cumarina diminuir similarmente a 6-hidroxicumarina (composto 3). A adição de NO2 nas posições C6 (composto 12) e C7 (composto 17) da cumarina per se parece não ser requisito para atividade antibacteriana (com CIMs variando entre 1000 e superior a 2000 μg/mL) bem como a adição de radical amino (NH2) em 6-aminocumarina (composto 8). 

• A halogenação da cumarina em C6 e C7 produzindo 6-clorocumarina (composto 6) e a 7-clorocumarina (composto 16) faz atividade diminuir, enquanto que a adição de átomo de iodo em 6-iodocumarina (composto 7) a torna inativa contra todas as bactérias testadas. 

Diferentes modificações na cumarina (composto 1) na posição C6, resultando em 6-carboxicumarina (composto 9), 6-cianocumarina (composto 10) e 6-aldeidocumarina (composto 11), fazem a atividade diminuir ou até mesmo a inativam com CIMs iguais ou superiores a 2000 μg/mL.

• Os compostos 18, 19, 20, 21 (Tabela VII) são cumarinas com duas substituições em qualquer das três posições (C6, C7 e C8). Todas essas substituições resultaram em diminuição da atividade antibacteriana, quando os compostos foram comparados com a cumarina per se com exceção da esculetina que com relação a bactérias Gram-positivas demonstrou atividade similar da cumarina per se. Resultados semelhantes a estes foram divulgados por Kayser; Kolodziej (1999, p. 172) onde os autores afirmam que a atividade antibacteriana das cumarinas monossubstituídas não aumenta de maneira significativa com a adição de mais um grupo funcional. 

A introdução de dois radicais metoxi nas posições C7 e C8 (composto 21) diminui a atividade antibacteriana se comparado a cumarina per se (composto 1). Na esculetina (6,7 dihidroxicumarina, composto 19) a adição de hidroxilas nas posições C6 e C7, provavelmente, facilitou a passagem da substância através do peptoglicano e com isso, ocorreu a atividade (CIM = 500μg/mL) contra Gram-positivas. A atividade da esculetina contra bactérias Gram-positivas já havia sido descrita por Tegos e colaboradores (2002, p. 3136). 

• Os autores ainda comentam sobre a possibilidade do incremento da atividade contra Gram-negativas pelo bloqueio das bombas de efluxo (famílias de proteínas especializadas em expulsar substâncias nocivas às células para o meio extracelular) dessas bactérias (TEGOS et al., 2002, p. 3136). 

As cumarinas umbeliferona (7-hidroxicumarina) e dafnetina (7,8-dihidroxicumarina) não foram fornecidas para teste para que houvesse comparação da atividade antibacteriana entre uma OH em C7 e duas em C7 e C8. Jurd et al. (1971, p. 2972) demonstraram que a alquilação da dafnetina resultando em 7-O-metil, ou dimetil ou dialil resulta na perda da atividade antimicrobiana da mesma. 

• Apesar da 7-hidroxicumarina (umbeliferona) não ter sido usada para testes nesse estudo, relatos prévios mostram que a presença do radical OH na posição C7 também resulta em decréscimo na atividade da cumarina contra todas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (KAYSER; KOLODZIEJ, 1999, p. 172). 

A metoxilação nas posições C6 e C7 gerando Di-metoxi-esculetina (composto 20), diminui a atividade antibacteriana para ambos os grupos de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Kayser; Kolodziej (1999, p. 172) demonstraram que a introdução de um grupo metoxi em C6 diminui a atividade antibacteriana da 7- metoxicumarina. 

• A manutenção do grupo O-metil em C6 e a adição de um radical hidroxila em C7, diminui a atividade (CIM=1000 μg/mL, composto 18). Os resultados com escopoletina (composto 18) e Di-metoxi-esculetina (composto 20) indicam que o radical metoxi em C6 diminui a atividade antibacteriana da cumarina (composto 1) bem como dois grupos metoxi em C7/C8.

A cumarina fraxetina (composto 22) representou o grupo dos análogos trissubstituídos, apresentou atividade diminuída para ambos os grupos de microorganismos (Tabela VIII). A adição de um radical O-CH3 na posição C6 ou a presença de duas hidroxilas nas posições C7 e C8, provavelmente devem ter alterado a configuração espacial do composto e com isso diminuiu a afinidade aos sistemas de transportes ou sítios de interação bacterianos. Kayser; Kolodziej (1999, p. 171) testaram a atividade da 7,8-dihidroxicumarina (dafnetina) e observaram CIM de 1000 μg/mL para todas as cepas testadas. 

• A fraxetina demonstrou fraca atividade antibacteriana possivelmente porque falta um grupo adicional metoxi. Kayser; Kolodziej (1999, p. 171) estudaram análogos trissubstituídos e tetrassubstituídos e os derivados mais ativos foram aqueles possuindo dois grupos metoxi em C5 e C6 ou C6 e C7.

A presença do anel furano condensado ao núcleo cumarínico, fez com que a atividade do psoraleno (composto 29) diminuísse duas vezes com relação às bactérias Gram-negativas e o tornou inativo contra Gram-positivas, até a concentração testada. A adição de um grupo metoxi em C5 (composto 24) diminuiu a atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativa e contra Gram-positivas. 

• A metoxilação na posição C9 (composto 32) também fez a atividade diminuir contra Gram-negativas e restituiu a ação da cumarina per se (composto 1) para Gram-positivas. A adição de grupos metoxi na posição C5 (composto 29) e C9 (composto 25) fizeram a atividade diminuir contra bactérias Gram-negativas e restituiu a atividade da cumarina per se (composto 1) contra Gram-positivas. 

Por outro lado, o derivado dimetoxi C5-C9 gerando isopimpinelina (composto 26), reduziu a atividade chegando a ser inativa contra S. aureus. Clausindina (composto 28) e 3 α,α Di-Metil-psoraleno (composto 30) são furanocumarinas C-preniladas (cadeia ramificada de 5 carbonos) Essas substituições apresentaram atividade antibacteriana diminuída provavelmente pela posição do radical prenil em C3. 

• A estrutura da unidade prenílica do composto 28 e do composto 30 na posição C3 não interferiu na atividade. O (-)-heraclenol (composto 23) e imperatorina (composto 27) são furanocumarinas O-preniladas em C9, sendo ainda que o grupo prenil do composto 23 é hidroxilado e do 27 não. 

A oxidação da unidade isoprenílica formando o derivado ß-γ-dihidroxil-9-O-prenil (composto 23, (-)- heraclenol) pode ser responsável pela restituição da atividade da cumarina (composto 1) contra bactérias Gram-positivas com relação ao composto 27. Isoangenomalin (composto 33), chalepina (composto 32) e marmesin (composto 31) são cumarinas são C7-prenil cumarinas. 

• Ambas furanocumarinas (31 e 33) exibiram diminuição da atividade antibacteriana, sugerindo que a presença de radical prenil hidroxilado ou não, na posição C7 diminui a atividade contra os dois grupos de bactérias. A atividade da cumarina chalepina (composto 32) é similar ao dos compostos 33 e 31, sugerindo que a presença de radical prenil é irrelevante para atividade antimicrobiana da cumarina per se. 

Das furanocumarinas angulares, (onde a fusão do anel furanico ocorre entre os carbonos C8 e C9 do núcleo cumarínico originando uma estrutura angular tal como) a angelicina (composto 35) apresenta atividade aumentada com relação ao composto 1, sugerindo que esta formação estrutural em angulo realçou a atividade da cumarina per se contra bactérias Gram-negativas e diminuí contra bactérias Gram-positivas. 

• Os compostos 34 e 36 não apresentaram atividade. Parece que o grupo isopropil inibe a atividade destes compostos para as bactérias Gram-negativas. Contra as Gram positivas, a atividade antibacteriana parece estar relacionada com o grau de oxidação deste radical isopropil. 

Existem muitas variáveis para explicar as diferenças com relação à estrutura e especificidade de espectro bacteriano, porém se sabe que a estrutura espacial, a polaridade, o tamanho das cadeias substituinte e a presença de mecanismos de resistência bacteriana são aspectos importantes no composto para a atividade antimicrobiana.

• As piranocumarinas (cumarinas que possuem um anel pirano condensado ao anel aromático do núcleo cumarínico, nos carbonos C9-C8 - angulares como lineares, nos carbonos C7-C8) constituíram uma classe de derivados cumarínicos testados com pouca ou nenhuma atividade antibacteriana, com CIMs iguais ou superiores a 2000 μg/mL contra todas as cepas testadas. Os resultados sugerem que a presença do anel pirano condensado cumarina, não é um fator estrutural importante para a atividade antibacteriana da cumarina.

Dentre as cumarinas preniladas (Tabela XI), a balsamiferona (composto 43), o aurapteno (composto 41), o febalosina (composto 42), o preniletina (composto 46) e 7-O-geranil-esculetina (composto 45) mostraram-se ineficazes contra todas as cepas testadas. 

• A única exceção foi o ostenol (composto 44), uma C7-hidroxi-C8-prenil cumarina que teve atividade surpreendentemente mais intensa com CIM = 62.5 μg/mL contra bactérias Gram-positivas, porém diminuída contra bactérias Gram-negativas em relação ao composto 1. Os resultados mostram a importância da C9-prenilação para a atividade antibacteriana. No entanto, a oxidação da unidade prenílica e migração da dupla do composto 42 (febalosina) tornaram o mesmo inativo. 

Estas observações sugerem que a adição de um radica prenil em C9 aumenta a afinidade (composto 44), porém sua oxidação inibe tal afinidade (composto 42). O composto 43 apresenta hidroxila em C8, e um radical prenil em C3 e outro em C7, todavia apresentou atividade antibacteriana diminuída contra as cepas testadas, sugerindo que a presença de grupos volumosos nestas posições (C7 e C3) impedem que a molécula se aproxime do sítio ativo ou receptor da bactéria. 

• Os demais substituintes prenilados como preniletina (composto 46), 7-O-geranil-esculetina (composto 45), ou aurapteno (composto 41) demonstraram pouca atividade, sugerindo que em C7, tanto a presença de radical prenil (composto 46), como uma cadeia prenilóxi (composto 41 e 45) bem como a concomitante adição de grupo OH ou metoxi torna a atividade dos derivados pouco notável.

Além das concentrações inibitórias nas tabelas de VI a XI, estão dispostas as concentrações bactericidas mínimas (CBM). Se observarmos a razão entre CIMs e CBMs para as cumarinas com atividade inibitória de até 1000 μg/mL constata-se que na maioria dos casos, (86%) o valor obtido não foi superior a quatro vezes, indicando que de maneira geral, as cumarinas apresentam atividade bactericida.

• A cumarina per se (composto 1) foi o composto que de maneira geral, apresentou a melhor atividade antibacteriana. Substituições no anel básico deste composto original alteraram a atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, conforme segue abaixo:
• A adição de radicais menos polares (CH3 e O-CH3) nas posições C6 ou C7 da cumarina manteve a atividade contra bactérias Gram-negativas.
• A O-acetilação nas posições C6 são ineficazes, porém a O-acetilação na posição C7 faz a atividade antibacteriana aumentar contra ambas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas em relação a cumarina per se.
• Cumarinas aminadas nas posições C6 ou C7 apresentaram atividade diminuída ou até mesmo mostraram-se inativas contra todas as cepas, em relação ao composto 1.
• Radicais ciano, carboxi e aldeído na posição C6 diminuiram a atividade antibacteriana das cumarinas contra ambas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
• Na esculetina (6,7 dihidroxicumarina) o radical orto-dihidroxil, favoreceu a ação, principalmente, contra bactérias Gram-positivas. A O-metilação da esculetin em C6 e C7 diminuiu a atividade para os dois grupos de bactérias.
• Hidroxilas nas posições C7 e C8 na 6-metóxicumarinas fizeram a atividade antibacteriana diminuir contra todas as cepas bacterianas.
• Cumarinas furanoangulares mostraram relação estrutura atividade diversificada. O estudo mostrou que a presença de radical isopropil em C8 predispôs a atividade antibacteriana contra bactérias Gram-positivas e pouca atividade contra Gram-negativas. Na ausência desse radical, a suscetibilidade dos microrganismos foi invertida, sendo fraca contra Gram negativas e aumentada contra Gram-positivas.
• Piranocumarinas foi a única classe de cumarinas inativas contra as bactérias estudadas. O anel extra de seis elementos pareceu influir negativamente na atividade antibacteriana.
• Cumarinas preniladas necessitam de uma hidroxila na posição C7 e um radical prenil na posição C8 para se mostrarem ativas contra as bactérias Gram-positivas. Essa estrutura, entretanto, não é ativa contra Gram-negativas.
• Sugere-se estudar a cumarina per se, bem como o ostenol e angelicina como protótipos (líder) para futuras explorações referentes a trabalhos relacionando a atividade antimicrobiana de compostos cumarínicos.

A Cumarina - (Canela, pimentas)